search
ruРусский
banner
Дом / Новости / ДИСК
Новости
pageSearch
Последние новости

ДИСК

Jan 14, 2024Jan 14, 2024

Том 13 научных докладов, номер статьи: 12383 (2023) Цитировать эту статью

552 доступа

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Многоклеточные опухолевые сфероиды, встроенные в матрицы коллагена I, являются распространенными системами in vitro для изучения солидных опухолей, которые отражают физиологическую среду и сложности среды in vivo. Хотя среда коллагена I физиологически значима и допускает инвазию клеток, изучение сфероидов в таких гидрогелях представляет собой проблему для ключевых аналитических анализов и широкого спектра методов визуализации. Хотя это во многом связано с толщиной 3D-гидрогелей, которую в других образцах обычно можно преодолеть путем разрезания, из-за их высокопористой природы гидрогели коллагена I очень сложно разрезать, особенно таким образом, чтобы сохранить сеть гидрогеля, включая клетки. модели вторжения. Здесь мы описываем новый метод подготовки и криосекции инвазивных сфероидов в двухкомпонентной (коллаген I и желатин) матрице, метод, который мы называем двойным гидрогелем in vitro сфероидным криосрезом трехмерных образцов (DISC-3D). DISC-3D не требует фиксации клеток, сохраняет архитектуру инвазивных сфероидов и их окружения, устраняет проблемы с визуализацией и позволяет использовать методы, которые нечасто применяются в трехмерном анализе сфероидов, включая микроскопию сверхвысокого разрешения и масс-спектрометрическую визуализацию. .

Исследование in vitro клеток, культивируемых на плоских двумерных (2D) подложках, проводится уже более столетия и сыграло решающую роль в бесчисленных научных открытиях. Хотя 2D-культура клеток продолжает оставаться стандартным методом в молекулярной и клеточной биологии, давно признано, что она не может резюмировать важные аспекты систем in vivo, включая трехмерные (3D) взаимодействия клетка-клетка и клетка-окружающая среда1. Такие взаимодействия особенно важны при изучении клеточных процессов, которые являются явно возникающими и многоклеточными; например, при развитии, росте и прогрессировании солидной опухоли.

В последние годы все шире применяется 3D-культура клеток2. Здесь многоклеточные объекты выращивают или готовят из клеточных линий или тканей пациента — обычно называемых сфероидами и органоидами соответственно — и культивируют в синтетических или природных гидрогелях, которые имитируют внеклеточный матрикс in vivo. Было показано, что трехмерная культура клеток лучше воспроизводит физиологию тканей человека, такую ​​как градиенты питательных веществ и кислорода, различные пролиферативные зоны, а также взаимодействия клетка-клетка и клетка-матрица, что дает четкое обоснование для использования 3D-культуры для изучения биологических вопросов, которые многоклеточные по своей природе3,4,5,6. Среди 3D-гидрогелей среда коллагена I демонстрирует особую физиологическую значимость для многих солидных опухолей. При раке молочной железы высокая плотность коллагена I является известным фактором риска развития заболевания7,8, а особая плотность и пространственная организация коллагеновых волокон вокруг опухолей связаны с прогнозом9. Взаимодействия между клетками и богатым коллагеном стромальным микроокружением также важны при раке поджелудочной железы10,11 и участвуют во множестве других видов рака12. Коллаген I также является привлекательной средой для 3D-культуры клеток, поскольку его биохимия и сетевая структура способствуют эффективной клеточной инвазии. Более того, это среда, в которой физические свойства, такие как ширина волокон, размер пор и жесткость гидрогеля, можно легко настроить без изменения биохимического состава, что позволяет изучать влияние этих свойств на инвазивный режим и эффективность клеток13,14,15,16 .

Несмотря на то, что хорошо известно, что 3D-культура клеток и, в частности, гидрогели коллагена I, обеспечивают высокую степень физиологической значимости и возможности отделить влияние биохимии от физических свойств на поведение клеток, внедрение 3D-культуры клеток было относительно медленный. Нежелание частично проистекает из проблем, связанных с получением изображений оптической микроскопии высокого разрешения в таких средах6. Клетки чувствуют и реагируют на жесткость окружающей среды на расстояниях, по меньшей мере, в десятки, а возможно, и в сотни микрон17. Таким образом, чтобы клетки вели себя так, как в изотропной трехмерной среде, они должны располагаться значительно выше жестких подложек для визуализации. Это может привести к тому, что клетки будут находиться за пределами рабочего расстояния типичных объективов с высокой числовой апертурой, высокому фоновому сигналу из-за рассеяния за пределами плоскости изображения и автофлуоресценции клеток или гидрогеля, окружающего клетки. Более того, трехмерная среда может препятствовать диффузии небольших молекул или антител через образец, препятствуя как исследованиям лекарств, так и введению флуоресцентных меток в этих контекстах. Проблемы, связанные с 3D-образцами, могут быть особенно острыми в наиболее информационно насыщенных подходах, таких как оптическая визуализация со сверхвысоким разрешением, где первостепенное значение имеет соотношение сигнал-шум, корреляционные подходы, в которых используются несколько модальностей, и неоптические подходы, такие как масс-спектрометрия. визуализация, при которой рассеяние на толстых образцах исключает сбор данных, за исключением поверхности образца.

 0.05 (n = 12, 59, and 46 slices for 3D, DISC-3D, and DISC-3D re-stained, respectively)./p> 0.05./p> 100 μm into the gel [3D high], and (bottom) following DISC-3D preparation (4 μm slices). From left to right, the columns show images taken using widefield microscopy, confocal microscopy, Airyscan imaging, lattice SIM, and STORM in a HILO implementation. No image is presented for 3D STORM imaging in the top two rows because (3D low) filtering out-of-plane light was insufficient or (3D high) the technique could not be implemented at such depths. Scale bar = 20 μm. (b) Mean measured full width at half maximum (FWHM) of collagen fibers from each microscopy technique. Error bars show standard deviation. Expected minimum FWHM of each approach is shown via dashed horizontal lines. (c) Pore size of collagen networks determined across imaging techniques and sample preparations (see Methods for details). Error bars show standard deviation. Statistical significance, number of samples assessed, and additional information about resolution of each technique are provided in Fig. S4./p> 100 μm into the gel, referred to as 3D high, middle row), and following DISC-3D preparation and cryosectioning (bottom row). All gels investigated were subjected to the first portion of the DISC-3D protocol, the addition and gelation of gelatin. Thus, the only difference between the samples in the DISC-3D images (bottom row) and the other samples (top and middle rows) is that the DISC-3D samples were frozen, removed from the sample wells, and sectioned. First, we note that qualitatively, images of the hydrogel collected near the coverslip appear similar to images of DISC-3D samples across techniques, suggesting that hydrogel structure is not adversely affected by the DISC-3D sample preparation procedure. Generally, DISC-3D samples show enhancements in image quality for all microscopy techniques explored. Widefield microscopy, which suffers from out of plane signal for 3D samples, shows obvious gains in image quality for DISC-3D samples relative to intact 3D samples (Fig. 4a, leftmost column). Confocal microscopy, Airyscan, and SIM, while providing excellent image quality and revealing consistent fiber morphology low in the gel, also show declines in image quality at increased imaging depths (Fig. 4a). We note that imaging at such depths assures the cells interrogated do not sense the underlying stiff substrate; therefore, maximizing image quality in this region is critical for studying cell behavior in a physiologically relevant context. STORM images were poor, and fibers were difficult to discern both low and high in the 3D gels, ostensibly due to challenges filtering out of plane emission in this highly scattering sample, as such filtering is critical to identification and localization of single fluorophores. The enhancement in image quality observed for DISC-3D samples opens the door to revealing details about system microstructure that would not otherwise be accessible in traditional 3D culture contexts./p> 0.95, Fig. S4a). For most microscopy techniques explored here, we find fiber widths larger than the expected fiber thickness of 50–100 nm, consistent with the measured resolutions of these techniques (Fig. 4, Fig. S4c). Given that the true fiber width falls below measured resolutions for widefield, confocal, Airyscan, and SIM, only STORM imaging—which can only be applied to DISC-3D samples—can accurately report fiber thickness (Fig. 4b). Here, we find a fiber width of approximately 75 nm in DISC-3D samples, in good agreement with measurements by electron microscopy and atomic force microscopy46./p> 0.05. (d,e) Representative normalized mass spectra collected from invasive spheroids following the DISC-3D protocol at (d) 24 °C and (e) 350 °C demonstrating the increase in signal intensity in the ≈ 650–900 m/z regime. Number at right on each panel indicates maximum intensity peak at that temperature. (f) Representative mass spectrometry images prepared following the DISC-3D protocol outlined in Fig. S1d, showing consecutive sections of single spheroids for several signal ions. In the first serial section of each signal ion, the spheroid core is marked by a white dotted line and the invasive front is denoted by a red dotted line. Color scale from minimum to maximum intensity is shown for signal ions at right. Scale bar = 500 μm./p> 100 photons) and standard deviation of the fitted Gaussian (> 50 nm and < 250 nm) to remove noise and poor-quality fits. Noise was further reduced by using a DBSCAN-based filter to remove outlier molecules in sparsely populated regions of the imaging area (Epsilon = 50 nm, MinPts = 5). After these post-processing steps, images were drift-corrected using cross-correlation with a bin size of 5. Molecules in post-processed and drift-corrected images were visualized using the “Normalized Gaussian” rendering with a lateral uncertainty set to 10 nm./p> 0.05) is denoted by a dagger (†). A denotes statistical significance and is described in the relevant figure caption when employed./p>

Предыдущий: Длинный Следующий: Короткий
Отправить запрос
Отправлять